ویژگی های محتوای کیسه ذخیره اسپرم ملکه های پیر و جوان

تلقیح مصنوعی یک تکنیک مهم برای بهبود و کنترل  اصلاح نژاد دام است، با این حال، منی، همانطور که برای اکثر گونه ها نشان داده شده است، ظرف چند ساعت یا چند روز در باروری خود کاهش می یابد. بنابراین پروتکل‌های انجمادی برای مایع منی انسان و چندین گونه جانوری دیگر برای ذخیره‌سازی طولانی مدت آن در طول دهه‌ها ایجاد شده است.

تا همین اواخر نگهداری انجماد با کیفیت کافی دشوار بود, در چندین گونه از حشرات، پرندگان و خزندگان، اسپرم را می توان به طور طبیعی پس از جفت گیری ماه ها یا حتی سال ها در اندام خاصی که در ماده های جفت شده یافت می شود ذخیره کرد. با این وجود، مطالعات متعددی کاهش کیفیت اسپرم را در طول نگهداری نشان داده است، به نظر می رسد که ملکه زنبور عسل یک مدل ایده آل برای مطالعه ذخیره اسپرم در ماده ها باشد زیرا زنبورهای عسل این مزیت را دارند که منی تولید میکنند که چندین سال زنده می ماند و برای مدیریت در تحقیقات زنبورداری مناسب هستند.

اطلاعات کمی در مورد نحوه حفاظت از اسپرم در اسپرماتکای حشرات، از جمله ملکه زنبور عسل در دسترس است.

ملکه زنبور عسل (Apis mellifera) در اوایل زندگی  در طول پرواز با تعدادی زنبور نر جفت گیری می کند. اسپرم در طول عمر ملکه ها در اسپرماتکا ذخیره می شود و تا پنج سال زنده نگه داشته می شود و قابلیت لقاح را دارد. تعداد کل اسپرم‌های استخراج‌شده از اسپرماتکای ملکه‌های های تازه جفت‌گیری کرده بین ۱تا ۸ میلیون در هر ملکه متغیر است. اندازه طول اسپرم زنبور عسل ۲۵۰ تا ۲۷۰ میلی متر است. سر اسپرم تشکیل شده است  از آکروزوم قدامی و هسته که ۵ میلی متر طول، 0.5 میلی متر عرض و 0.3 میلی متر ضخامت دارد، آکسونم بخش مرکزی دم را تشکیل می دهد با نه(9 ) میکروتوبول تک جانبی که بیشتر بیرونی هستند و به دنبال آن نه جفت و جفت مرکزی, مانند سایر گونه های حشرات دم اسپرم زنبور عسل حاوی دو مشتق میتوکندری است که از پایه هسته تقریبا تا انتهای دم امتداد دارند.

محققان دریافتند که غلظت Na+ و K+ در مایع  کیسه ذخیره اسپرم ملکه فاکتور  مهمی است برای سرکوب برگشت پذیری حرکت اسپرم و طول عمر، هم در داخل بدن ( داخل بدن موجود زنده یا همان درون تنی)  هم در شرایط آزمایشگاهی ( همان برون تنی) .  همچنین افزودن آمینو اسیدهای اگزوژن ( برونی ) (ال-لیزین، ال-آرژنین، ال-گلوتامیک اسید) و آنزیم کاتالاز, به تعداد زیادی از اسپرماتوزئیدهای فعال تنفسی اجازه می دهد تا سال ها در اسپرماتکا زنده بمانند .

مقدار پی اچ ۸/۶ به بالا و غلظت پروتئین 8.5-15.3 mg/ml در مایع اسپرماتکال نشان داده شده است .و فرض  بر این است که این مقادیر برای ذخیره سازی طولانی مدت اسپرم مهم است . محققان همچنین نشان دادن که شیره اسپرماتکای ملکه های جفت شده دارای فعالیت بسیار بالایی برای آنزیم ها است. ویریچ و همکاران  (2002) ثابت کرده اند که  اسپرماتکای ملکه های جفت شده فعالیت بسیار بالا و قابل توجهی را برای آنزیم ها  کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون اس ترانسفراز (GST) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) از خود نشان میدهند که منجر میشود این آنزیم های اسپرماتکال به محافظت از اسپرم در برابر استرس اکسیداتیو کمک کنند و در نتیجه بقای طولانی مدت آنها را تسهیل می کنند. این آنزیم‌ها می‌توانند طول عمر اسپرم را با کاهش سطوح مخرب انواع اکسیژن های فعال ROS (هیدروکسیل، رادیکال‌های هیدروپروکسیل و پراکسید هیدروژن) افزایش دهند. این مطالعه مطابقت دارد با تحقیقات کالینز و همکاران، که انعکاس کاتالاز را به ویژه در بافت های تولید مثل و منی زنبور عسل نر و ماده پیدا کرده اند بدین ترتیب شواهد بیشتری از محافظت انتی اکسیدانی  فراهم میشود.

کرافت و همکاران  (1978) یک تجزیه و تحلیل مقایسه ای بر روی تولید  CO2 اسپرم  انجام دادن و دریافتن مصرف گلوکز تنفسی اسپرم زنبور عسل است به طور نسبی در مقایسه با اسپرم گونه های دیگر کم تر است, با این وجود، اسپرم فعالیت تنفسی خود را در طول ذخیره سازی حفظ می کند، که احتمالاً خطر بالایی از آسیب اکسیداتیو را شامل می شود.

در این مطالعه، ما بینش بیشتری در مورد برخی از ویژگی های ذخیره اسپرم در اسپرماتکا زنبور عسل ارائه می دهیم.

تغییرات در طی دو سال ذخیره در اسپرماتکا با توجه به تعداد، سرعت و تحرک اسپرم و همچنین ظرفیت متابولیسم انرژی ، تجزیه و تحلیل شده است.

متابولیسم انرژی برای همه سلول‌های زنده ضروری است و مسیر درون سلولی که ATP را تحویل می‌دهد با محیط سلول، عملکرد آن، و منبع سوختی که در دسترس است سازگار است. کربوهیدرات ها و چربی دو سوخت اصلی هستند اما سایر سوخت ها مانند   لاکتات یا اسیدهای آمینه را نباید نادیده گرفت.  مزیت کربوهیدرات ها این است که ATP را می توان در غیاب اکسیژن (متابولیسم بی هوازی) تولید کرد. و می توان آنها را به عنوان پلیمر گلیکوژن در داخل سلولی ذخیره کرد, دومین ذخیره انرژی فسفاژن (فسفوآرژینین در حشرات) است.برای بازسازی سریع ATP در طول فعالیت یا برای انتقال درون سلولی فسفات غنی از انرژی استفاده می شود.

افزایش حداکثر فعالیت‌ها نشان‌دهنده افزایش سنتز آنزیم‌ها است به طوری که سلول‌ها می‌توانند با تقاضای انرژی بالا سازگار شوند. در حالی که کاهش حداکثر فعالیت ها یا با تخریب کنترل شده آنزیم یا با آسیب سلولی ایجاد می شود.

برای اسپرم زنبور عسل، کربوهیدرات ها برای تولید ATP مهم هستند و دو مشتق بلند و طویل  میتوکندری نشان دهنده متابولیسم هوازی هستند.

برای بررسی اینکه آیا ظرفیت متابولیسم انرژی اسپرم و اسپرماتکا در طول سن ملکه ها تغییر می کند یا خیر، ما حداکثر فعالیت آنزیم‌های دخیل در متابولیسم هوازی و بی‌هوازی کربوهیدرات را همراه با فعالیت‌های فسفاژن کیناز مورد تجزیه و تحلیل قرار داده‌ایم که نشان‌دهنده اهمیت بافر ATP یا سیستم شاتل انرژی می باشد

مواد و روش ها

ملکه‌های جفت‌گیری طبیعی( جفت ازاد) با سن مشخص از چندین زنبوردار و مکان‌های مختلف نمونه‌برداری شدند و تا زمان آزمایش در کندوچه های کوچک جفت‌گیر نگهداری شدند.

در دو مجموعه  آزمایشی در سال‌های 2005 و 2006، منی از اسپرماتکای هر یک از ۱۴ملکه تازه جفت شده (Y0)، ۱۴ ملکه یک ساله (Y1) و ۷ ملکه دو ساله (Y2) مورد بررسی قرار گرفتند.

علاوه بر این، در سال 2006، محتوای اسپرماتکا هر یک از ۲۰ ملکه باکره ی یک هفته ای (WVQ) و ۲۰ ملکه باکره یک ماهه (MVQ)  و مایع منی تازه (۳۶ میلی لیتر) جمع آوری شده از ۴۶ نر بالغ مورد بررسی قرار گرفت.

جمع آوری منی از نرها و اسپرماتکای ملکه های باکره برای تعیین این موضوع بود که آیا فعالیت آنزیمی اندازه گیری شده در اسپرماتکال ملکه های جفت شده ناشی از اسپرم موجود است یا از بافت کیسه ذخیره اسپرم.

نتایج

تعداد اسپرم، الگوی حرکت و سرعت

تعداد اسپرم در اسپرماتکای ملکه زنبور عسل با گذشت زمان به طور قابل توجهی   کاهش معنی داری پیدا کرد. (شکل 1)

به طور میانگین، در اسپرماتکای ملکه های یک ساله (Y1) تنها 38٪ و در ملکه های دو ساله (Y2) تنها 21٪ از تعداد اسپرم ، در مقایسه با ملکه های تازه جفت شده (Y0) پیدا شد ، و درحالی که تفاوت بین ملکه های تازه جفت شده و Y1 و Y2 بسیار معنی دار بود، تفاوت بین Y1 و Y2 معنی دار نبود. همچنین با سن ملکه های جفت شده، الگوی حرکت اسپرم ذخیره شده در اسپرماتکا نیز به طور قابل توجهی تغییر کرد. اسپرم ملکه های تازه جفت شده (Y0) فقط با الگوی حرکت دایره ای انجام می شود (شکل 2a) همانطور که توسط زلنسکی و شیندلر توضیح داده شده است.

چون اسپرم در جهات مختلف چرخیده و در داخل مایع در امتداد متفاوت مسیرها حرکت کرده،  می‌توانیم این احتمال را که این نوع حرکت فقط یک واکنشی صرفاً  به جریان کلی مسیر  باشد، کنار بگذاریم.

مشخص شد که اسپرم Y2(ملکه های دوساله )  فقط در یک جهت مستقیم حرکت می کند (شکل 2b)، اما آنها همچین مسیرهای متفاوتی را نیز در پیش گرفتند. اسپرم Y1( ملکه های یک ساله )  هر دو نوع حرکات را نشان داد: 75٪ مستقیم به جلو و 25٪ با الگوهای حرکت دایره ای, علاوه بر این، سرعت اسپرم بسته به زمان ذخیره شده در اسپرماتکا به طور قابل توجهی متفاوت بود.(شکل ۳) به ویژه، اسپرم نمونه برداری شده از ملکه های Y2( دوساله ) به طور قابل توجهی حرکتی کندتر از اسپرم Y0 یا Y1 بود .

فعالیت آنزیمی

حداکثر فعالیت آنزیم های لاکتات  دهیدروژناز (LDH)، گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH), سیترات سنتاز (CS) و آرژنین کیناز (ArgK) و مشخص کردن متابولیسم انرژی در منی تازه نرها و در اسپرماتکای ملکه های جفت شده را نشان میدهد  (شکل 4).

در اسپرماتکای ملکه‌های باکره، فعالیت آنزیم‌ها در عرض یک ماه به مقادیری بالاتر از ۱۰ به توان ۶ اسپرم تبدیل شد.

در ملکه های جفت شده، فعالیت های آنزیمی نیز با افزایش سن، در جهت متفاوت و به میزان متفاوت تغییر می کند. فعالیت LDH با سن  ملکه ها افزایش یافته، فعالیت GAPDH تفاوت معنی داری نداشت، اما فعالیت های CS و ArgK به طور معنی داری کاهش یافت (جدول 1).

اسپرماتکای ملکه های تازه باکره (یک هفته ای) نشان داد فعالیت آنزیمی پایین 

و عدم فعالیت LDH و GAPDH می باشد . ملکه‌های باکره یک ماهه فعالیت بیشتری در تمام آنزیم‌ها از جمله LDH و GAPDH در اسپرماتکا نشان دادند.

بحث

تعداد اسپرم در کیسه ذخیره اسپرم

حدود ۸ میلیون اسپرم در اسپرماتکای ملکه های جوان زنبور عسل مشاهده شده که ما به طور متوسط ​​فقط 3.5 میلیون اسپرم در هر اسپرماتکا پیدا کرده ایم . تعداد اسپرم وابسته به سن به طور قابل توجهی در اسپرماتکا نشان داده شد. این را می توان به راحتی با این واقعیت توضیح داد که ملکه ها تا 2000 تخم در روز می گذارند , و در هر غشای تخمک تا 12 اسپرم نفوذ می کند.

ذخیره و حرکت اسپرم

اسپرم به‌دست‌آمده از اسپرماتکای ملکه‌های جوان (Y0) حرکتی منحصراً دایره‌ای انجام می‌دهد، در حالی که ۲۵ درصد از اسپرم‌های به‌دست‌آمده از ملکه‌های Y1 مستقیماً به جلو حرکت می‌کنند. و این  در حالی است که قبلا گزارشات فقط اسپرم های متحرک یا مستقیم از ملکه های Y2 بدست آمده بود.

این نتیجه،  یک اثر تجربی تخصصی نیست که به تفاوت های وابسته به سن در تراکم اسپرم نسبت داده شود، زیرا همه نمونه ها به اندازه کافی برای اندازه گیری الگوی حرکت یا سرعت، رقیق شده بودند.

حرکت دایره ای اسپرم همچنین در یک نوعی سوسک  بنام ( rove beetle) پیدا شده است. این نویسندگان فرض کردند که حرکات دایره‌ای شدید اسپرم  به این دلیل به وجود می‌آید که اسپرم‌های بلند برای جلوگیری از درهم‌تنیدگی به این نوع حرکت  در طول نگه داری در اسپرماتکا نیاز دارند.

این همچنین ممکن است به اسپرم های تکی کمک کند تا توده اسپرم را برای لقاح باروری ترک کنند. محققان وضعیت گردش مداوم  اسپرماتوزوا را در مگس سرکه مشاهده کرده و نشان دادن که این حرکت ممکن است به رهاسازی  اسپرم به صورت تکی( یکی یکی ) کمک کند. اگرچه این گونه ها از نظر طول ذخیره منی متفاوت هستند، اما این مکانیسم ممکن است بین گونه ها مشابه باشد.

بسته بندی اسپرم با تراکم بالا احتمالاً یکی از استراتژی های کلی برای ذخیره سازی طولانی مدت است، در حالی که حرکت دایره ای  یک پیش نیاز است برای آزادسازی اسپرم تکی از اسپرماتکا بدون رقیق شدن، هیپرتونیک بودن اسپرماتکا احتمالاً دومین استراتژی است که تا حدودی مسئول ذخیره سازی موفق و طولانی مدت اسپرم در ملکه زنبور عسل است.

فشار اسمزی مایع اسپرماتکال  به طور مستقیم در آزمایش های گزارش شده اندازه گیری نشده  اما مقدار محاسبه شده (بر اساس غلظت کل یونی و قند اندازه گیری شده در اسپرماتکا) به اندازه مایع منی کامل، پلاسمای منی یا همولنف ملکه است. هیپرتونیک احتمالاً متابولیسم را در طول ذخیره سازی کند نگه می دارد و نتیجه آن حرکت دایره ای اسپرم می شود. می توان حدس زد که اسپرم های کشیده ی یافته شده در ملکه های مسن نشان دهنده کاهش هیپرتونیسیته اسپرماتکا است، یافته ای که ممکن است ذخیره سازی را بیشتر مختل کند.

تحقیقات بر روی اسپرم حشرات هنوز نادر است و احتمالا مکانیسم‌های دیگری هم که بر ذخیره طولانی مدت اسپرم در اسپرماتکا  تأثیر می‌گذارد وجود دارد  . برای مثال پروتئین های خاصی توسط ملکه زنبور عسل برای بهبود ذخیره سازی اسپرم تولید می شود. همانطور که آکسونم به پایه سر اسپرم متصل می شود، این نیروی لغزشی به خم شدن تاژک تبدیل می شود.از آنجایی که داینئین( نوعی موتور پروتئین ) تنها در یک جهت نیرو تولید می کند. تولید یک شکل موج تاژکدار معمولی مستلزم فسفوریلاسیون/دفسفوریلاسیون و فعال سازی مرتبط است. غیرفعال شدن بازوهای داینئین به صورت نامتقارن و غیرهمزمان در اطراف محیط و در طول آکسونم رخ می دهد. بنابراین، حرکت دایره‌ای اسپرم، همانطور که در نتایج ما دیده می‌شود، با حداقل یا  فرکانس ناچیز ضربان تاژک‌ها همراه است، که به انرژی خروجی کم نیاز دارد.حرکت رو به جلو (فرکانس ضربان بالاتر) ممکن است پر هزینه تر باشد.

متابولیسم انرژی اسپرم‌

تحرک اسپرم در بسیاری از گونه ها با تولید ATP ( ادنوزین تری فسفات ) توسط میتوکندری همراه است، زیرا اکسیداسیون کامل سوبستراهایی مانند قند، چربی یا پروتئین ها به میتوکندری نیاز دارد.و بازده ATP بسیار بالاتر است (گلوکز/36 ATP) نسبت به تخمیر قند مستقل از میتوکندری (گلوکز / 2 ATP) به لاکتات. در اسپرماتوزوئید بسیاری از گونه ها میتوکندری ها در یک قطعه کوتاه از تاژک می باشند  و در نتیجه انرژی باید به تمام dynein-ATPases در امتداد تاژک منتقل شود. مطالعات روی اسپرم خارپشت دریایی به فرضیه سیستم انتقال انرژی منجر شده است.

فسفات غنی از انرژی ATP توسط کراتین کیناز میتوکندری به کراتین منتقل می شود و  محصول فسفوکراتین به Dynein-ATPase منتقل می شود این سیستم فسفوکراتین/کراتین کیناز در اسپرم بسیاری از گونه‌های مختلف یافت شده، در حالی که اسپرم‌های بندپایان و نرم تنان حاوی سیستم فسفوآرژینین/ArgK هستند. ، ArgK در اسپرم‌های زنبور عسل یافت شده است و فعالیت آن نسبتاً زیاد است. به نظر می رسد این نتیجه کلی است  به این دلیل که میتوکندری در اسپرم زنبور عسل وجود ندارد و محدود به قطعه کوتاه تاژک است, دم ها شامل دو رشته میتوکندری  هستند که از پایه هسته تقریبا تاانتهای دم امتداد دارند. بنابر این این سوال مطرح می شودکه آیا شاتل فسفوآرژینین/ ArgK ضروری است یا خیر.  تجزیه و تحلیل بیشتر در مورد نقش ArgK و بخش بندی آن در اسپرم زنبور عسل باید انجام شود. متابولیسم انرژی اسپرم را می توان با حداکثر فعالیت آنزیم های نشانگر که ظرفیت های مسیرهای متابولیک مختلف را منعکس می کند، مشخص کرد.GAPDH ظرفیت گلیکولیز را نشان می دهد، در حالی که LDHفعالیت  میزان تولید یا مصرف لاکتات را نشان می دهد. نشانگر (CS) چرخه اسید سیتریک است و ArgK پتانسیل بالقوه گردش فسفاژن و شاتل فسفاژن پیشنهادی در اسپرم را منعکس می کند.

نتایج ما با نتایج بلوم و تابر (1965) مطابقت دارد که فعالیت‌هایی را برای دهیدروژنازهای مختلف مرتبط با چرخه کربس و گلیکولیز در اسپرم زنبور عسل یافته‌اند.این نشان دهنده حضور فعلی هر دو مسیر است و با گزارش Kraft و همکاران در تناقض است. در سال (1978) که گزارش داده بودن اسپرم زنبور عسل از چرخه کربس استفاده نمی کند. در حالی که تمام آنزیم ها در اسپرم های حاصل از منی تازه نرها وجود دارند، به نظر می رسد LDH و GAPDH، به طور خاص، سنتز شده در بافت اسپرماتکال ملکه ها ظرف یک ماه پس از تولد می باشد . فعالیت تمام آنزیم های مورد مطالعه در ملکه ها در عرض یک سال پس از جفت گیری نسبتاً ثابت است که نشان دهنده حفظ خوب ظرفیت تولید ATP است. با این حال، پس از دو سال، فعالیت آنزیم میتوکندری  IS و ArgK بیشتر از LDH و GAPDH کاهش می یابد. اینکه آیا این یک اثر آسیب میتوکندری است هنوز باید مورد بررسی قرار گیرد .

شکل 1. تعداد اسپرم به دست آمده از کیسه ذخیره اسپرم ملکه های تازه جفت شده(0 Y) ، ملکه های یک ساله (Y1) و ملکه های دو ساله (Y2). و به طور قابل توجهی معنی دار بوده که با حروف مختلف نشان داده شده ایت.

شکل 2. تصاویر میکروسکوپی معمولی اسپرم از ملکه های تازه جفت شده (الف) و ملکه های دو ساله (ب).

شکل ۳) حرکت (میلی‌متر) اسپرم‌های نمونه‌برداری شده از اسپرماتکای ملکه‌های با سن متفاوت رانشان میدهد ( یعنی ملکه های تازه جفت خورده ، یک ساله و دوساله)  که تفاوت معنی داری را نشان میدهند .( سرعت اسپرم بسته به زمان ذخیره شده در اسپرماتکا به طور قابل توجهی متفاوت است، حرکت اسپرم های ملکه های دوساله به طور قابل توجهی کندتر از تازه جفت خورده و یا یکساله می باشد  )

فعالیت آنزیمی LDH، GAPDH، CS و Arg-K.

جدول ۱ : حداکثر فعالیت آنزیمی لاکتات دهی دهیدروژناز (LDH)، گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH)، سیترات سنتاز (CS) و آرژنین کیناز (Arg-k ) را نشان میدهد .

فعالیت آنزیمی LDH، GAPDH، CS و Arg-K.

جدول ۱ : حداکثر فعالیت آنزیمی لاکتات دهی دهیدروژناز (LDH)، گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH)، سیترات سنتاز (CS) و آرژنین کیناز (Arg-k ) را نشان میدهد .

به اهتمام مهندس رضا حاجی زاده